Вернуться на главную страницу | К списку лекций

Версия для скачки/печати: Скачать * формат .doc

Страница 1

Прионовые инфекции

Актуальность темы
Одним из выдающихся научных достижений ХХ века в области биологии и медицины стало открытие в 1982 году американским молекулярным биологом, профессором Стенли Прюзинером нового типа инфекционных агентов - прионов. Это не просто важный этап в развитии молекулярной биологии. Это новая эра развития биологии и медицины, поскольку выявлен принципиально новый тип инфекционных заболеваний, отличающийся своей природой возникновения и развития. По степени сложности строения прионы относятся к наиболее простым из известных на сегодняшний день инфекционным агентам.
Мотивационная характеристика темы. Знание темы необходимо для изучения прионовых заболеваний на многих кафедрах института, таких как инфекционные болезни, психиатрия, эпидемиология, нервные болезни, педиатрия, внутренние болезни. В практической деятельности врача оно необходимо для клинико-анатомической дифференциальной диагностики с медленными вирусными инфекциями и некоторыми соматическими заболеваниями нервной и мышечной систем.
Цель обучения - уметь определять по макро- и микроскопической картине признаки прионовых инфекций, объяснить причины и механизм их развития, оценить вероятный исход и определить значение осложнений для организма.
Для реализации этой цели необходимо уметь:
определить отличительные морфологические признаки прионовых инфекций от вирусных инфекций;
объяснить морфогенез трансмиссивных спонгиоформных энцефалопатий человека;
объяснить морфогенез трансмиссивных спонгиформных миопатий человека;
оценить значение осложнений и определить возможные причины смерти.
Прионы - представляют собой беспрецедентный класс инфекционных агентов, составленных только из измененных белковых молекул хозяина. Прионы не содержат нуклеиновых кислот и, таким образом, отличаются от всех известных микроорганизмов, таких как бактерии, грибки, вирусы и вирусоподобные частицы. После многократных пассажей в культуре было доказано, что патогенные прион-протеины, способные к трансмиссии, являются мутантами клеточной изоформы нормального приона протеина. К настоящему времени установлено 18 различных мутаций гена PrP человека, которые связаны с различными прионовыми болезнями.
Протеин-прион (PrP) представляет собой сиалогликопротеид с молекулярной массой 33000-35000 дальтон, или 33-35 kD, кодируемый единственным геном, расположенным у человека в 20 хромосоме. Он состоит у человека приблизительно из 254 аминокислот, включая 22-членный N-терминальный сигнальный пептид. Прион PrP(с) найден у всех млекопитающих. Его жизненный полупериод составляет несколько часов, но он хорошо сохраняется в течение развития. Прионы очень устойчивы к различным физико-химическим воздействиям (табл. 1).
Таблица 1
Характеристика устойчивости прионов к различным воздействиям

Реактивы	Дозы	Эффект воздействия
Физико-химическое воздействие
NH2OH	0,1-0,5 мM	Устойчив
Псорален	10-500 мг/мл	Устойчив
Фенол	100%	Инактивация
SDS	1-10%	Инактивация
Zn2+	2 мM	Устойчив
Мочевина	3-8 M	Инактивация
Сода	1N в течение 1 часа при 20°C	Инактивация
Гипохлорид натрия	2,5% в течение 1 часа при 20°C	Инактивация
Обработка ферментами
ДНK-аза A	0,1-100 мг/мл	Устойчив
ДНK-аза	100 мг/мл	Устойчив
Протеиназа K	100 мг/мл	Инактивация
Трипсин	100 мг/мл	Инактивация
Физическое воздействие
Автоклавирование	136°C в течение 18 минут	Инактивация
Сухой жар	160°C в течение 24 часов	Инактивация
УФ	Сильные дозы	Устойчив

Прионы устойчивы к кипячению в течение 30-60 мин, высушиванию до 2 лет, замораживанию в 3 раза большему, чем известные вирусы, химической обработке спиртами, формальдегидом, кислотами, к УФ-облучению, гамма-излучению, гидролизу ферментами. Наиболее эффективные воздействия оказываются в дозах, которые денатурируют практически все белки. Иначе говоря, из всего живого прион погибает последний.
PrP-с входит в состав наружных клеточных мембран, связан с внешней поверхностью клеток якорем гликолипида и участвует в эндоцитозе и катаболизме клеток. Несмотря на то, что самый высокий уровень концентрации PrP выявлен в нейронах, его могут синтезировать и многие другие клетки организма. Роль нормального протеин - приона (PrP) у здоровых индивидуумов еще до конца неизвестна. Прион протеин необходим для нормальной синаптической функции. Предполагается, что прионы принимают участие в межклеточном узнавании и клеточной активации. Некоторые считают, что их функцией является подавление возрастных процессов и поэтому прионовые болезни сходны по своим клиническим и морфологическим характеристикам с геронтологическими заболеваниями.
Протеин-прион (PrP) существует в двух формах:
в виде нормальной, неинфекционной формы, которая встречается в головном мозге, как в норме, так и у инфицированных больных. Эта форма обозначается как клеточный протеин-прион, или PrPc;
изоформа, или PrPsc (от "scrapie" болезнь овец), которая является патологической, инфекционной формой и накапливается в головном мозге только у больных людей и животных, страдающих спонгиформной трансмиссивной энцефалопатией.
Классификация. В настоящее время у человека известны две группы заболеваний, вызываемые прионами:
спонгиформные трансмиссивные энцефалопатии;
спонгиформный миозит с прион-ассоциированными включениями.
Наиболее изученными на сегодняшний день являются спонгиформные трансмиссивные энцефалопатии.
Патогенез прионовых энцефалопатий. Исходя из установленного факта, что прионовые болезни уникальны с генетической и с инфекционной точки зрения, Prusiner S.B. предложил в 1991 году современную концепцию патогенеза спонгиформных трансмиссивных энцефалопатий. Суть ее состоит в том, что человек может быть инфицирован прионами двумя способами:
Наследственная передача по-Менделю (аутосомно-доминантный тип наследования). Однако, это не prima facie наследование, а последовательное - через предварительную генную ауторепликацию инфекционного агента.
Трансмиссия инфекционного агента алиментарным или ятрогенным путем
Прионовые заболевания являются одновременно и инфекционными, и наследственными болезнями. Они могут быть и спорадическими в том смысле, что имеются случаи, в которых не выявляют никакого известного фактора риска, хотя наиболее вероятно, что инфекция была приобретена одним из двух ранее указанных способов. Исходя из современных знаний, трансмиссия прионовых энцефалопатий определяется тремя факторами: дозой инфекта, путем инфицирования, видовым барьером.
Доза инфекционного агента, полученная хозяином, зависит от количества ткани инфекта и его вирулентной способности (инфекционный титр). Но необходимо всегда помнить, что при повторной экспозиции обязательно существует риск кумулятивного эффекта.
Путь инфицирования прионами играет важную роль в развитии заболеваний и имеет свою определенную иерархию. По степени значимости его можно определить в такой последовательности:
интрацеребральный;
интравенозный;
интраперитонеальный;
подкожный;
оральный.
В качестве примера зависимости дозы и пути поступления инфекта служат эксперименты, которые показали, что доза, необходимая для заражения прионами мышей при оральном пути должна быть в 200 000 раз выше, чем при интрацеребральном.
Видовой барьер. Трансмиссия прионовых спонгиформных энцефалитов у лабораторных и диких животных длительное время является предметом многочисленных исследований. Замечено, что при первом проявлении болезни у определенного вида животных время инкубации очень длительное, тогда как после первого же пассажа новому хозяину в пределах этого же вида, оно сокращается. В последующих пассажах оно уменьшается еще больше до тех пор, пока не достигнет стабильного периода, характерного для данного вида. Эта устойчивость к прионовой инфекции у различных видов получила название "видовой барьер". Установлено, что для преодоления видового барьера и распространения заражения внутри самого вида необходимы очень высокие дозы инфекта. Однако исследователи обратили внимание на тот факт, что при одинаковой дозе инфекта трансмиссивность подострых спонгиформных энцефалитов в одних случаях (например, скрапи овец) зависит от источников агента, а в других - сразу и от вида донора, и от вида реципиента.
Обнаружено, что при различных способах введения патологических прионов через различные периферические пути, включая брюшную полость, желудок, инфекционный агент сначала появляется в клетках лимфоретикулярной системы миндалин, тимуса, лимфатических узлов и особенно селезенки. В первую очередь инфект определяется в B-клеточных зонах. Авторы показали, что дифференцированные B - лимфоциты принимают участие в нейроинвазии прионов. Это, по их мнению, может иметь значение для предупреждения болезни, и использовано в терапевтических целях.
При алиментарном заражении, прионы в Пейеровых бляшках тонкой кишки проникают через клеточные мембраны во внутренние структуры лимфоидных клеток, откуда в дальнейшем они попадают в другие органы иммунной системы: лимфоузлы, селезенку, миндалины и др. В этих органах возможна частичная репликация прионов. Предполагается, что дендритные клетки являются пермиссивными для периферической репродукции прионов. Из органов иммуногенеза прионы по нервам достигают ближайших аксонов. В области аксона может происходить их значительная репликация. При достижении критической концентрации прионы продвигаются по направлению к спинному, а затем головному мозгу.
После подкожного заражения грызунов прионы выделяются из селезенки (1-я неделя после заражения), из селезенки и лимфатических узлов (5- 13-я неделя), из спинного мозга (13-17-я неделя) и из головного мозга (17-19-я неделя). Установлено, что патологические изменения в мозге появляются на 25-й неделе, а клинические проявления начинают регистрироваться с 34-й недели. Все пораженные органы содержат до 10 млн. инфекционных единиц на 1 г, однако в них, за исключением головного мозга, не обнаруживается никаких патологических изменений. По некоторым данным, максимум инфекционности достигается к 40-му дню, т.е. задолго до клинического заболевания, у внешне совершенно здорового животного, когда еще нельзя распознать болезнь и принять меры по профилактике и лечению. Из этого обстоятельства вытекают трудности ранней диагностики и опасность передачи инфекции с продуктами питания.
Экспериментально доказано, что репликация прионового агента может происходить как в нейронах, так и в глиальных элементах. Некоторые авторы считают, что астроциты и другие глиальные клетки, возможно, играют ключевую роль в патогенезе прионовой инфекции. Это подтверждается высоким уровнем цитокинов на поздней ст0дии заболевания. К тому же на линейных мышах, у которых инфицированы были только глиальные клетки, получена морфологическая картина спонгиозной энцефалопатии.
Инфицированность органов иммуногенеза подразумевает перенос инфекционного агента с кровью. Однако, ни в инкубационном периоде, ни в преклинической стадии, ни даже в разгар болезни пока не находят биологических сдвигов в периферической крови.
После внутрицеребрального внедрения в животный организм прион-протеина PrP-Sc, он начинает избирательно накапливаться в мозге. Имеются доказательства существования транспорта PrP-с и PrP-Sc вдоль аксонов. Большинство клеточных прионов протеина присоединяются к внешней поверхности мембраны клеток якорем гликопротеидов после прохождения через комплекс Гольджи. Подобно другим протеинам, изоформа прион протеина PrP Sc проходит внутрь клетки через фиссуры, находящиеся на поверхности клетки. В отличие от клеточной изоформы прион протеина PrP Sc накапливается в клетке.
Иммуноэлектронно-микроскопические исследования указывают на то, что накопление PrP(Sc) происходит в структурах вторичных лизосом, содержащих фигуры миелина, богатые фосфолипидами. После повреждения лизосом и гибели клетки прионы заселяют другие клетки. Внутриклеточное накопление PrP-Sc в головном мозге проявляется спонгиформной дистрофией нейронов, гибелью нервной клетки и реактивным астроцитозным глиозом, что и определяет нейроморфологию прионовых заболеваний.
Патоморфология прионовых энцефалопатий. Нейропатология прионовых болезней человека характеризуется 4 классическими микроскопическими признаками:
спонгиозным изменениями;
потерей нейронов;
астроцитозом;
формированием амилоидных бляшек.
Макроскопически во всех случаях прионовых энцефалопатий отмечено незначительное уменьшение массы головного мозга, в отдельных наблюдениях отмечена умеренная атрофия извилин, главным образом у лиц с пролонгированным течением заболевания.
Микроскопически прионовая спонгиформная энцефалопатия характеризуется наличием множества овальных вакуолей (спонгиоз) от 1 до 50 микрон в диаметре в нейропиле серого вещества конечного мозга. Эти вакуоли выявляются в любом слое коры мозга. Они могут быть отдельными или группами, разделенными на участки. На парафиновых срезах вакуоли выглядят оптически пустыми, однако, в некоторых из них при окраске гематоксилином и эозином нередко выявляется мелкая зернистость. Вакуоли могут сливаться в микрокисты (200 микрон и более), в результате чего существенно искажается цитоархитектоника коры. В цитоплазме больших нейронов коры также может выявляться вакуолизация.
Помимо коры спонгиозные изменения нейропиля и вакуолизация цитоплазмы нейронов отмечаются по ходу всех полей аммоновых рогов, по ходу зубчатой фасции, в области подкорковых ядер, таламусе и коре мозжечка. Вовлечение в патологический процесс мозжечка является наиболее характерным проявлением этой болезни, хотя степень спонгиоза в нем очень вариабельна. Слияние вакуолей не характерно для мозжечковых повреждений. Спонгиоз чаще представлен микровакуолями диаметром 1-50 микрон, расположенными в молекулярном слое.
Спонгиформные изменения постоянно сопровождаются уменьшением числа нейронов различных отделов коры. В основном страдают нейроны III-VI слоя. В отдельных сохранившихся нейронах отмечается вакуолизация цитоплазмы, некоторые нейроны сморщены, гиперхромны. Степень выпадения нейронов коррелирует с выраженностью спонгиформных изменений и соответствует длительности заболевания. Описанные признаки сочетаются с пролиферацией клеток астроглии. В пролиферирующих астроцитах обнаружены различные дистрофические изменения, начиная с вакуолизации цитоплазмы и кончая появлением тучных форм с последующим клазматодендрозом. Миелиновые волокна коры остаются сохранными.
При длительном течении заболевания наиболее выражены вакуолизация и выпадение нейронов, что сопровождается спонгиозным статусом, с широко распространенной во всех отделах грубой вакуолизацией, полным коллапсом цитоархитектоники коры головного мозга в виде нерегулярного искаженного каркаса глиальной ткани с небольшими вкраплениями сохранившихся нейронов. Вообще, чем длительнее течение болезни, тем более явными будут микроскопические изменения. В базальных ганглиях и таламусе выраженная гибель нейронов может сочетаться с глиозом и атрофией. В мозжечке наблюдаются резкие дистрофические изменения вплоть до их гибели в зернистых клетках и клетках Пуркинье. Сохранившиеся клетки Пуркинье гиперхромные, набухшие, с явлениями тигролиза и лизисом ядер. Миелиновые волокна, прилежащие к коре и ядерным группам мозжечка, часто варикозно вздуты, с явлениями фрагментации. Вместе с тем, необходимо подчеркнуть, что демиелинизация волокон при всех формах прионовых болезней не наблюдается.
Одним из морфологических признаков прионовых энцефалопатий является наличие прион-протеиновых (PrP) бляшек, которые обычно видны как округленные эозинофильные структуры. Изучение структуры и топографии PrP бляшек имеет большое как теоретическое, так и практическое значение. Количество, локализация и даже микроскопические признаки бляшек вариируют в различных формах и типах прионовых энцефалопатий. Такие бляшки характерны для болезни Куру. Многие авторы их так и называют Kuru-бляшки. Реже они встречаются при спорадической и семейной БКЯ, но очень часто (более 70%) при ее новой форме. В единичных наблюдениях их описывают при семейной фатальной инсомнии.
Очень часто PrP амилоидные бляшки локализуются в клетках зернистого слоя коры мозжечка, но могут также локализоваться в молекулярном слое и в белом веществе. Они, как правило, окружены бледно-розовым ореолом. Интенсивность окрашивания бляшек различна. Возможно, поэтому их не всегда удается обнаружить. Для этого используют стандартные иммуногистохимические методы с PrP антителами. В обнаруженных полимерах протеина, после окраски Конго-рот, при поляризационной микроскопии выявляется зеленое двойное лучепреломление.
Спинной мозг практически визуально сохранен. Лишь иногда отмечают значительное уменьшение числа мотонейронов. Ни в одном из наблюдений не было выявлено демиелинизации белого вещества спинного мозга. Несмотря на относительно высокую концентрацию прионов, выявляемую в периферических нервах, выраженных структурных изменений в них не наблюдается.
Клиника всех форм прионовой энцефалопатии может быть представлена разнообразной неврологической симптоматикой, обусловленной вакуолизацией и гибелью нейронов (основной механизм действия прионов на клеточном уровне) практически в любом отделе серого вещества мозга, включая мозжечок. Типичным является:
Расстройства чувствительной сферы: амнезия различной степени, потеря и извращение чувствительности, выпадение функций органов чувств.
Нарушения в двигательной сфере: атаксия, обездвижение, атрофия мышц, в том числе дыхательных, параличи.
Нарушения психики: утрата профессиональных навыков, депрессия, сонливость, агрессивность, снижение интеллекта вплоть до полного слабоумия.
При развитии клинических проявлений нет ни признаков воспаления, ни биологических аномалий в крови или в энцефало-арахноидальной жидкости, ни тестов неинвазивных, ни прямых, ни косвенных, позволяющих уверенно поставить диагноз. Электроэнцефалограмма сомнительна. Клинический диагноз подтверждается только при гистопатологическом изучении центральной нервной системы: спонгиоз с вакуолизацией нейронов, пролиферация астроцитов и глии без признаков воспаления и демиелинизации.
Группа прионовых подострых трансмиссивных спонгиформных энцефалопатий человека включает:
болезнь Крейтцфельда-Якоба (БКЯ);
синдром Герстмана-Страусслера-Шейнкера, (ГСШ);
синдром "фатальной семейной бессонницы" (ФСБ);
болезнь Куру;
хроническую прогрессирующую энцефалопатию детского возраста или болезнь Альперса.

Страница 2